五味子多糖均质酶解提取工艺优化（一） 五味子属木兰科植物

五味子属木兰科植物，味多其主要含有多糖类、糖均木脂素类、质酶三萜类、解提黄酮类以及挥发油等化合物。取工具有益气生津、艺优收敛固涩、味多补肾宁心等作用。糖均此外，质酶五味子主要成分有保护中枢神经系统、解提抗菌、取工抗氧化应激、艺优抗肿瘤、味多抗衰老等作用。糖均

多糖是质酶由单糖通过糖苷键聚合形成的生物大分子，广泛存在于植物、动物、微生物和藻类等，具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、抗炎等多种药理活性；多糖传统的提取方法是热回流提取，存在能耗高、时间长、效率低等不足；现代提取工艺有超声提取、微波提取、酶解提取等；提取工艺的研究是多糖研究的基础，它不仅影响提取的效率，而且会影响多糖的活性。

采用均质酶解提取法提取五味子多糖，与传统浸提、回流等方法相比，均质提取法具有提取时间短、效率高、操作简便、等优点，本实验首次采用均质酶解法提取五味子多糖，在单因素的基础上，采用响应面法优化多糖提取工艺，为植物多糖的生产提供了一种高效、环境友好的方法，为五味子多糖在医药、健康食品等领域的广泛应用提供了理论基础。

一、材料与方法

1、仪器与材料

MH2000电子调温电加热套（北京化玻医疗器械有限公司），T10BS25分散机（德国IKA公司），FA16004N电子分析天平（上海箐海仪器有限公司），MULTIFUZESER高速离心机（ThermoFisher公司），RV10DS25旋转蒸发仪（德国IKA公司），1601紫外分光光度计（北京北分瑞利分析仪器公司），FD-1E-50冷冻干燥机（北京博医实验仪器有限公司），DC-1000A高速多功能粉碎机（浙江省武义鼎藏日用金属制品厂），SU8000扫描电镜（日本日立）；五味子购于长春农贸市场，果胶酶（500u/mg，上海腾跃生物技术有限公司），其他试剂均为分析纯。

2、实验方法

（1）五味子多糖的均质酶解提取

将干燥后的五味子粉碎，依次用石油醚、90%的乙醇回流，除去色素、脂质类物质以及低聚糖和小分子物质，蒸发溶剂，得到预处理样品。准确称取预处理后的五味子3.0g，用液料比为25mL/g的果胶酶水溶液浸泡12h，在选定的条件下提取，然后以转速为3500r/min离心15min，上清液减压浓缩至一定体积，用95%乙醇在4℃条件下醇沉12h，沉淀冷冻干燥得到粗多糖。提取后的残渣晾干，用扫描电镜观察其组织破坏程度。

（2）五味子多糖的热回流提取

取一定量的预处理样品，按照100mL/g溶剂原料比加入蒸馏水，浸泡12h，在96℃温度下回流提取4h，将干燥后的五味子粉碎，依次用石油醚、90%的乙醇回流，除去色素、脂质类物质以及低聚糖和小分子物质，蒸发溶剂，得到预处理样品。准确称取预处理后的五味子3.0g，用液料比为25mL/g的果胶酶水溶液浸泡12h，在选定的条件下提取，然后以转速为3500r/min离心15min，上清液减压浓缩至一定体积，用95%乙醇在4℃条件下醇沉12h，沉淀冷冻干燥得到粗多糖。提取后的残渣晾干，用扫描电镜观察其组织破坏程度。得到回流提取粗多糖。提取后残渣晾干，用扫描电镜观察。

（3）葡萄糖标准曲线的绘制

准确称取葡萄糖标准品加蒸馏水溶解、定容，配制成质量浓度0.1g/mL的葡萄糖标准溶液。

精密吸取葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于25mL具塞试管中，加水至2.0mL，加入1.0mL5%苯酚溶液，最后加5.0mL浓硫酸，静置5min，然后在40℃水浴中加热30min，以试剂空白溶液为参比，在490nm波长处测定吸光度（Abs），用Abs对浓度C（mg/mL）回归，制得标准曲线C=8.4939×Abs+0.152，其中R²=0.999，标准曲线如下如图1。

计算公式如下：

多糖得率（%）=（V×C×F×W₂/W₃×W₁）×100；

式中：C-由回归方程计算所得的多糖的浓度（g/L），V-溶解W₃定容后体积（L），F-换算因子；W₁-原样质量，W₂-由W₁提取的粗多糖的质量（g），W₃-从W₂中称取用于分析测定的粗多糖的质量。

（4）单因素试验

固定其他条件，分别以加酶量（0.01、0.02、0.04、0.05g）、提取时间（1、2、3、4、5min）、提取温度（35、45、55、65、75℃）和均质转速（8000、11500、14500、17500、20500r/min）作为变量，考查各因素对多糖提取得率的影响。

(5)BBD试验和数据分析

选取提取温度、提取时间和均质转速三个因素为自变量，每个因素选取三个水平（表1），以多糖提取得率（Y%）为响应值，采用BBD试验方案（表1）、响应面优化提取工艺参数。利用Design-Expert8.0软件进行数据统计分析。

二、结果与讨论

1、单因素实验

（1）提取时间对多糖提取得率的影响

准确称取预处理样品3.0g，以液料比25mL/g的1%果胶酶液浸泡6h，提取温度45℃，均质转速14500r/min时，分别考察提取时间1、2、3、4、5min对提取得率的影响，结果见图2（a）。由图2（a）可知，在1～2min内多糖提取得率随时间的增加快速提高，2min时多糖提取得率达到最高值，之后随时间的增加而降低。在1～2min时间范围内随时间的增加，组织细胞的破碎程度增加，胞内多糖的溶解、扩散的效率提高，提取
得率快速增加，且高速的剪切作用下，多糖的溶解和扩散均可在较短的时间内达到平衡，因此相对热回流提取，均质酶解提取需要的时间非常短；2min后，可能是多糖的糖苷键及果胶酶的结构在强烈的剪切作用下被破坏，导致多糖提取得率减少。因此，提取的最佳时间范围是1～3min。

（2）提取温度对多糖提取得率的影响

准确称取3.0g预处理样品，以液料比25mL/g的1%的果胶酶液浸泡6h，提取时间2min，均质转速14500r/min，分别考察温度35、45、55、65、75℃对提取得率的影响，结果见图2（b）。由图2（b）可知，在35～45℃温度范围内多糖提取得率随温度增加迅速增加，在45℃时提取得率达到最大值，之后随温度增加快速降低。分析可能的原因是在一定温度范围内，随温度的升高酶活性增加、多糖在水中的溶解度增大，多糖的溶解和扩散速率增加，提取得率快速提高。而当温度增加超过一定范围内，随温度的增加，酶的活性降低，多糖的结构也可能随温度增加而发生变化，致使提取得率下降。因此，选作45℃为单因素的最佳温度。

（3）均质转速对多糖提取得率的影响

准确称取3.0g预处理样品，用液料比25mL/g的1%的果胶酶液浸泡6h，提取温度45℃，提取时间2min时，考察均质转速分别为8000、11500、14500、17500、20500r/min时对提取得率的影响，结果见图2（c）。由图2（c）可以发现，均质转速在8000～14500r/min范围内，多糖提取得率随均质转速数的增加而增加，当均质转速为14500r/min时提取率最大，之后多糖提取得率随转速的增加缓慢下降。这可能是均质转速数增加，对固体原料组织的破碎程度增加，单位质量的固体组织的比表面积增加，溶剂与样品的接触更充分，多糖由组织内部向周围溶剂的扩散速率加快，多糖的提取得率增加；均质转速数较大时，多糖以及酶的结构可能被破坏，致使多糖提取得率出现缓慢降低。因此，最佳的均质转速为14500r/min。

（4）果胶酶用量对五味子多糖提取得率的影响

准确称取3.0g五味子，用液料比为25mL/g的不同浓度的果胶酶液浸泡6h，在提取温度45℃，提取时间为2min，均质转速14500r/min，分别考察果胶酶用量0.010、0.020、0.030、0.040、0.050g对五味子多糖提取得率的影响，结果见图2（d）。由图2（d）可知，在0.01～0.04g加酶量范围内，多糖提取得率随果胶酶加入量的增加提取得率由5.6%缓慢增加到6.6%，这可能是由于果胶酶量增加，酶解效果增加，提取得率增加；在加酶量为0.04g（1.33%）时，多糖提取得率达到最高，之后随果胶酶量的增加而下降。加酶量过多时，可能会使多糖在果胶酶和强烈的剪切作用下，多糖被降解，使提取得率降低。但相对其他3个影响因素，加酶量对多糖得率影响相对较小，但加酶量对提取成本的影响较大。因此果胶酶的最佳加酶量为1.33%，且不再进一步优化。

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